對(duì)于雙光子（2P）成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個(gè)比較大的深度限制因素，而對(duì)于三光子（3P）成像這兩個(gè)問(wèn)題大大減小，但是三光子成像由于熒光團(tuán)的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級(jí)的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強(qiáng)度的熒光信號(hào)。功能性3P顯微鏡比結(jié)構(gòu)性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時(shí)采樣神經(jīng)元活動(dòng)；需要更高的脈沖能量，以便在每個(gè)像素停留時(shí)間內(nèi)收集足夠的信號(hào)。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動(dòng)與行為聯(lián)系起來(lái)，需要同時(shí)監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動(dòng)，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會(huì)在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元?jiǎng)恿W(xué)，就需要MPM具備對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行快速成像的能力?？焖費(fèi)PM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)多光子顯微鏡銷售渠道。模塊化多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

多光子顯微鏡通過(guò)引入具有超高透射率、非常陡峭的邊緣和精心優(yōu)化的阻擋的濾光片，為多光子用戶帶來(lái)了增強(qiáng)的性能?？紤]到激發(fā)激光器和多光子成像系統(tǒng)的其他復(fù)雜元件通常需要多少投資，這些新的光學(xué)濾光片**了一種簡(jiǎn)單且廉價(jià)的升級(jí)，可以顯著提高系統(tǒng)性能。事實(shí)上，與傳統(tǒng)濾光片的褐**調(diào)相比，發(fā)射濾光片看起來(lái)像窗戶玻璃一樣清晰，而且LWP二向色鏡具有如此寬的反射帶，它們看起來(lái)像高反射鏡。發(fā)射濾光片還在Ti:Sapphire激光調(diào)諧范圍內(nèi)提供深度阻擋，這對(duì)于實(shí)現(xiàn)高信噪比和測(cè)量靈敏度至關(guān)重要。Ultima 2P Plus多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作帶寬足以覆蓋鈦藍(lán)寶石激光器的可調(diào)諧范圍和用于多光子顯微鏡的許多其它激光器的典型中心頻率。

多光子激光掃描顯微鏡行業(yè)發(fā)展，世界多光子激光掃描顯微鏡產(chǎn)業(yè)主要布局在德國(guó)和日本，德國(guó)是以徠卡顯微系統(tǒng)和蔡司為，而日本以尼康和奧林巴斯公司為，2020年，上述企業(yè)占據(jù)著世界多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)64.44%的市場(chǎng)份額，其發(fā)展戰(zhàn)略左右著多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的走向。目前世界市場(chǎng)對(duì)多光子激光掃描顯微鏡的需求在增長(zhǎng)，中國(guó)市場(chǎng)這方面的需求增長(zhǎng)更快，未來(lái)五年多光子激光掃描顯微鏡市場(chǎng)的發(fā)展在中國(guó)將具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

多光子顯微鏡因擁有較深的成像深度，和較高的對(duì)比度在生物成像中有著重要的意義，但是它通常需要較高的功率。結(jié)合時(shí)間上展開(kāi)的超短脈沖可以實(shí)現(xiàn)超快的掃描速度和較深的成像深度，但是其本身所利用的近紅外波段的光會(huì)導(dǎo)致分辨率較低。清華大學(xué)陳宏偉教授和北京大學(xué)席鵬研究員合作研究，結(jié)合了結(jié)構(gòu)光成像和上轉(zhuǎn)化粒子，開(kāi)發(fā)了一種基于多光子上轉(zhuǎn)化材料和時(shí)間編碼結(jié)構(gòu)光顯微鏡的高速超分辨成像系統(tǒng)(MUTE-SIM)。它可以實(shí)現(xiàn)50MHz的超高的掃描速度，并突破了衍射極限，實(shí)現(xiàn)了超分辨成像。相較于普通的熒光顯微鏡，該顯微鏡提升了，并且只需要較低的激發(fā)功率。這種超快、低功率、多光子的超分辨技術(shù)，在分辨率高的生物深層組織成像上有著長(zhǎng)遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。多光子顯微鏡之類的先進(jìn)光學(xué)技術(shù)能夠在活生物體的大腦表面下更深地成像。

當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，隨著刺激時(shí)間的增加，即使繼續(xù)刺激，Ca2+熒光信號(hào)也不會(huì)繼續(xù)增強(qiáng)，反而會(huì)減弱，直至恢復(fù)到無(wú)刺激時(shí)的水平。對(duì)于細(xì)胞受精過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)的變化，發(fā)現(xiàn)粘附過(guò)程中Ca2+熒光信號(hào)沒(méi)有變化，但當(dāng)配子融合時(shí)，Ca2+熒光信號(hào)強(qiáng)度出現(xiàn)一個(gè)不穩(wěn)定的峰值，持續(xù)數(shù)分鐘。這些現(xiàn)象對(duì)于研究受精發(fā)育的早期信號(hào)以及Ca2+在卵子和受精卵發(fā)育中的作用具有重要意義。在其他生理過(guò)程中，如細(xì)胞分裂和胞吐，Ca2+熒光信號(hào)的強(qiáng)度也會(huì)發(fā)生很大的變化。多光子顯微鏡中，極短的激光脈沖聚焦在樣品上的緊密點(diǎn)上，激發(fā)熒光團(tuán)產(chǎn)生圖像。美國(guó)飛秒激光多光子顯微鏡成像分辨率

雙光子共聚焦顯微鏡比單光子共聚焦顯微鏡具有更亮的橫向分辨率和縱向分辨率。模塊化多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位

因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后，發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí)，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測(cè)效率。模塊化多光子顯微鏡準(zhǔn)確定位