逆轉(zhuǎn)錄的過(guò)程與端粒復(fù)制，逆轉(zhuǎn)錄酶通常具有多種活性，如逆轉(zhuǎn)錄活性、復(fù)制活性與RNA酶H活性。逆轉(zhuǎn)錄活性可以RNA為模板，合成與其序列互補(bǔ)的DNA鏈，生成DNA-RNA雜合雙鏈。RNA酶H活性可以水解雜合雙鏈中的RNA，得到與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈（cDNA）。復(fù)制活性則用來(lái)合成雙鏈DNA。HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的活性部位。與復(fù)制類似，逆轉(zhuǎn)錄也是由5’向3’合成DNA，要求有模板和不少于四個(gè)核苷酸的引物。各種DNA聚合酶活性都需要引物，只有確認(rèn)引物正確配對(duì)，才會(huì)進(jìn)行DNA的合成。這是保證其忠實(shí)性的重要手段，逆轉(zhuǎn)錄酶也不例外。實(shí)驗(yàn)室合成cDNA時(shí)，經(jīng)常會(huì)用合成的寡聚T（oligodT）作為引物，與mRNA的polyA配對(duì)。這個(gè)過(guò)程比較簡(jiǎn)單，因?yàn)橐锝Y(jié)合在RNA鏈的末端，所以整條鏈的逆轉(zhuǎn)錄是一次性完成的。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前應(yīng)反復(fù)檢查所有試劑盒的有效期和使用條件。深圳快速逆轉(zhuǎn)錄混合企業(yè)

RNA逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：RNA定量：除了掌握RNA的完整性之外，反轉(zhuǎn)錄之前還需要對(duì)RNA濃度進(jìn)行測(cè)定。一般反轉(zhuǎn)錄試劑盒會(huì)對(duì)上樣量有要求，建議totalRNA上樣量小于5μg。超過(guò)這個(gè)范圍，會(huì)使反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物產(chǎn)生偏好性(表達(dá)豐度高的基因優(yōu)先被反轉(zhuǎn)錄)而造成定量結(jié)果不準(zhǔn)確。逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇：逆轉(zhuǎn)錄引物一般包含3種：oligodT引物，隨機(jī)引物和特異性引物。對(duì)于短的且不具備發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可用。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程中避免光照，防止RNA樣品和試劑受光降解或刺激。深圳快速逆轉(zhuǎn)錄混合企業(yè)逆轉(zhuǎn)錄酶通常具有多種活性，如逆轉(zhuǎn)錄活性、復(fù)制活性與RNA酶H活性。

逆轉(zhuǎn)錄酶的質(zhì)量控制：1.切口酶：在與200單位酶37oC保溫60分鐘后，超螺旋質(zhì)粒保留在90%以上。2.DNase測(cè)定：200單位酶與50ng3H-DNA37oC保溫60分鐘，分解出的放射性低于1%。3.RNase測(cè)定：200單位酶與50ng3H-RNA37oC保溫60分鐘，分解出的放射性低于3%。4.首先鏈cDNA的反應(yīng)：在標(biāo)準(zhǔn)化的反應(yīng)中，200單位酶催化從1mg1.2kbRNA或1mg7.5kbRNA將同位素?fù)饺氲絚DNA中，通過(guò)放射自顯影，對(duì)于1.2kb的RNA，產(chǎn)物cDNA是單一的、全長(zhǎng)的條帶。對(duì)于7.5kb的RNA產(chǎn)物有部分是全長(zhǎng)的條帶。用這二種RNA放射性轉(zhuǎn)換到cDNA中有12%。5.RNaseH活性：200單位酶與polyA:polydT37oC保溫60分鐘，釋放出的放射性要低于1%。

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶比AMV反轉(zhuǎn)錄酶缺乏連續(xù)性，因此要獲得像AMV反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)中產(chǎn)生同樣量的cDNA就要求使用較多單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。用1微克的mRNA起始合成首先條鏈的cDNA，要用8單位的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶才相當(dāng)于1單位的AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用。該酶很容易被亞精胺(Spermidine)所抑制，該酶非常不能用Promega的RiboprobeAMV反轉(zhuǎn)錄酶5X反應(yīng)緩沖液，也不能用Promega的RiboclonecDNA首先條鏈緩沖液，因?yàn)檫@二種緩沖液均含有亞精胺。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)可以選擇加入RNA合成抑制劑RNAse防止RNA降解和污染，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)過(guò)程需適當(dāng)?shù)腞NA質(zhì)量，過(guò)少或質(zhì)量不佳將影響擴(kuò)增效果。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)前要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行無(wú)RNA和無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的對(duì)照。

逆轉(zhuǎn)錄PCR的用途普遍，可用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、檢測(cè)細(xì)胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、病癥檢測(cè)、檢測(cè)病人標(biāo)本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環(huán)境脅迫對(duì)植物基因表達(dá)的影響，以及在特定的環(huán)境或生長(zhǎng)階段中植物體不同部位基因表達(dá)的差異性。使用RT-PCR檢測(cè)分析RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：理論上可以檢測(cè)幾乎任何基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；可以實(shí)現(xiàn)極為微量RNA樣品（ng級(jí)別）的檢測(cè)；樣品耐受性好，未經(jīng)純化的粗制生物樣品也可以用于檢測(cè)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)首先需要逆轉(zhuǎn)錄酶的反應(yīng)活性。南京莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄試劑費(fèi)用

高效的逆轉(zhuǎn)錄體系可提高反應(yīng)效率和檢測(cè)靈敏度。深圳快速逆轉(zhuǎn)錄混合企業(yè)

逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)步驟：引物濃度計(jì)算方法：（新合成的引物的稀釋）假如終濃度為XuM（pmol/ul）加DEPC水體積（ul）=（OD×33×1000000）/（分子量×X）。用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RT（10ul體積）1、準(zhǔn)備0.65mlEP管。2、加入4.5ulDEPC水，1ul引物，1ul模板RNA。3、稍離心，100℃沸水裕1min。4、加入0.5uldNTP，2ul5×Buffer，1ulAMV逆轉(zhuǎn)錄酶。5、稍離心，封口膜封口，42℃水浴90℃作RT。6、100℃沸水裕3min滅活A(yù)MV。7、立即PCR或－20℃保存。逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)時(shí)注意事項(xiàng)：為避免RNA酶污染，在RT中仍要佩戴一次性手套和口罩。深圳快速逆轉(zhuǎn)錄混合企業(yè)

蘇州英澤生物醫(yī)藥科技有限公司位于張家港經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)(市高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)服務(wù)中心)F幢3樓，交通便利，環(huán)境優(yōu)美，是一家生產(chǎn)型企業(yè)。英澤生物是一家有限責(zé)任公司（自然）企業(yè)，一直“以人為本，服務(wù)于社會(huì)”的經(jīng)營(yíng)理念;“誠(chéng)守信譽(yù)，持續(xù)發(fā)展”的質(zhì)量方針。公司業(yè)務(wù)涵蓋RNA\DNA試劑盒，外泌體提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR，價(jià)格合理，品質(zhì)有保證，深受廣大客戶的歡迎。英澤生物順應(yīng)時(shí)代發(fā)展和市場(chǎng)需求，通過(guò)**技術(shù)，力圖保證高規(guī)格高質(zhì)量的RNA\DNA試劑盒，外泌體提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR。