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泰州復制型腺相關病毒檢測操作流程

來源: 發(fā)布時間:2024-02-08

RCL復制型慢病毒檢測方法包括以下3種:①ELISA法(p24蛋白測定):適用于由載體生產(chǎn)過程中病毒基因組之間的重組形成RCL的檢測。但,對于VSV-G包膜質粒和來源于其他病毒的gal-pol基因功能組件之間發(fā)生重組不表達p24蛋白的假型病毒不適用。其優(yōu)點為適用性廣(濃縮載體、終末細胞、血清血漿等多種樣本)、靈敏度高和可定量等。②使用qPCR的方法測定VSV-G基因和PCR方法檢測由病毒載體質粒和包裝質粒重組產(chǎn)生的psi-gag基因序列,具有靈敏度高,可重復性和操作簡單等優(yōu)點。③測定逆轉錄酶活性的方法,它可以用來檢測RCL相關的不同結構的逆轉病毒,缺點為在某些細胞檢測中,存在背景高的現(xiàn)象。復制型病毒檢測試劑盒適用性樣品有哪些?泰州復制型腺相關病毒檢測操作流程

實時定量PCR方法(Q-PCR法)復制型慢病毒檢測原理:目前許多CAR-T申報企業(yè)采用Q-PCR/PCR方法直接測定終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi—gag序列,考慮到細胞產(chǎn)品一般需要新鮮輸注或快速凍存的特殊性,采用基于細胞培養(yǎng)方法,時間周期較長,建議在細胞產(chǎn)品制備過程中進行多控制(如對慢病毒載體及生產(chǎn)終末細胞采用基于細胞培養(yǎng)方法測定RCL,以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風險),細胞終產(chǎn)品階段可采用快速放行方法(如PCR方法)。基于Q-PCR法測定復制型慢病毒載體,主要是針對VSV-G序列設計定量引物,通過繪制標準曲線,對RCL予以定量。南京病毒檢測品牌南京正揚有重組腺相關病毒檢測試劑盒嗎?

用qPCR法進行rcAAV復制型腺相關病毒檢測時,出現(xiàn)擴增曲線復孔間熒光信號值降低及復孔間擴增曲線重復性差的原因可能是什么?復孔間部分曲線熒光信號值降低的現(xiàn)象比較常見,通常與反應管內(nèi)存在氣泡相關,隨反應溫度升高,氣泡破裂導致熒光信號值降低。上機前需仔細檢查反應管內(nèi)是否有氣泡殘留。另外,針對加樣誤差引起的復孔間重復性差,實驗人員上崗前需加強培訓并考核,移液器務必定期校準并正確掌握使用方法。此外,還需注意確保試劑與樣品混勻,離心后再上機。

國家監(jiān)督管理局審評中心(CDE)發(fā)布了《體內(nèi)基因治   療產(chǎn)品學研究與評價技術指導原則(試行)》,對基因治    療產(chǎn)品的質量屬性分析給出了指導意見,強調(diào)基于質量研究和關鍵質量屬性(Criticalqualityattributes,CQA)的鑒別建立完善的質量控制策略,常見的質量研究項目包括但不限于鑒別、結構分析、生物學活性、純度、雜質、含量、轉染/感    染效率、一般理化特性等。rcAAV復制型腺相關病毒作為生產(chǎn)過程中的工藝雜質,其限度尚未有明確的標準要求,行業(yè)普遍建議rAAV病毒原液或終產(chǎn)品(比原液多了分裝的工藝)中的rcAAV的含量應小于1rcAAV/10?rAAVvectorgenome,因此必須采用高靈敏度的方法才能對其進行檢測和定量分析。目前rcAAV復制型腺相關病毒檢測常采用2種方法,即基于細胞培養(yǎng)的檢測方法和qPCR快檢法。復制型病毒檢測試劑盒。

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用qPCR進行rcAAV復制型腺相關病毒檢測時,哪些因素會對檢測結果準確性和方法靈敏度存在較大影響?前處理過程雜質干擾的去除對qPCR法宿主細胞殘留DNA檢測結果有著較大影響。樣品的前處理操作步驟對DNA檢測結果的準確度影響較大,通常采用加樣回收試驗來進行驗證并確定可接受的偏離限度,內(nèi)標回收率在50-150%的范圍內(nèi)都可以接受。樣品提取步驟較為復雜,需要特別注意,操作不當不但可能影響回收率還可能引入環(huán)境污染。歡迎聯(lián)系南京正揚!泰州復制型腺相關病毒檢測操作流程

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