CERO生物反應器在阿爾茨海默病研究中的應用

來源：發布時間：2025-07-30

本研究探討了人類外周血單核細胞（hPBMCs）固定化對其在阿爾茨海默病細胞模型中依賴于Аβ42 聚集物的促炎狀態的影響。結果顯示，固定化細胞對異源刺激的基本指標水平及響應強度***高于懸浮細胞，且β1 整合素在細胞 - 基質粘附中起關鍵作用，阻斷后可抑制 rAβ42 誘導的 TNFα 和 Aβ40 積累，提示細胞粘附因素對研究結果的重要性130。

一、研究背景與目的

1. 阿爾茨海默病（AD）病理基礎：主要與淀粉樣變性和炎癥相關，Aβ40 和 Aβ42 是關鍵的淀粉樣 β 肽異構體，其中 Aβ42 更易聚集且致病性更強2。

2. 研究意義：外周血單核細胞（PBMC）常被用于評估 AD 相關分子（如 Aβ42）引發的細胞因子變化，但傳統懸浮培養未考慮細胞粘附因素，可能與體內環境存在差異，影響研究結果12。

3. 研究目的：探究 hPBMCs 的細胞 - 基質粘附對其體外促炎狀態的影響，比較懸浮細胞與固定化細胞對 Aβ42 刺激的響應，并分析 β1 整合素的作用13。

二、材料與方法1. 細胞來源與處理

1. 來源：健康成年捐贈者的 hPBMCs，經 Ficoll–Hypaque 方法分離，保存在 CryoStor® CS10 培養基中，細胞活力 92.0%，濃度 1.5×10?/ml456。

2. 培養方式：

l 懸浮培養：RPMI-1640 培養基（含 10.0% 胎牛血清等），24 孔板培養 24 小時（37.0±0.1°C、5.0±0.1% CO?）78。

l 固定化培養：CERO 生物反應器用于固定化細胞的培養，控制培養環境參數。采用 GEM 技術，將細胞固定在含 1.0% I 型膠原蛋白、0.5% RGD 肽和 1.0% 纖連蛋白的藻酸鹽微載體表面，在生物反應器中培養 24 小時91011。

CERO 3D細胞(類***)生物反應器

1. 實驗處理

1. rAβ42 刺激：濃度 15nM，超聲處理分散聚集體后加入細胞培養體系1213。

2. β1 整合素阻斷：hPBMCs 與抗 β1 整合素抗體（1:200）在 37°C 孵育 30 分鐘后進行固定化培養1415。

2. 檢測方法

1. 細胞因子（TNFα、IL-1β）和 Aβ40 含量：采用 ELISA 試劑盒，在 FL600 微孔板多模式閱讀器上檢測，結果以 ng/g 總蛋白表示161718。

2. 活細胞成像：使用激光掃描共聚焦顯微鏡（FV10i-LIV），通過熒光探針 CRANAD-2 和 MCAAD-3 分別觀察 rAβ42 和 Aβ40 的定位與積累，計算比值指數 R（rAβ42/Aβ40）192021。

3. 統計分析：單因素方差分析（ANOVA）結合 Tukey 多重比較檢驗，p<0.05 為差異***22。三、研究結果1. 細胞因子和 Aβ40 的變化

1. 無 rAβ42 時：TNFα 和 Aβ40 含量在 24 小時內無***變化，IL-1β 含量在 24 小時后***降低（懸浮細胞：285.2±15.6 ng/g；固定化細胞：304.1±15.5 ng/g）232627。

2. 有 rAβ42 時：

l TNFα 含量增加，24 小時時懸浮細胞達 108.3±11.5 ng/g，固定化細胞達 161.6±9.2 ng/g2627。

l Aβ40 含量增加，24 小時時懸浮細胞達 67.5±5.1 ng/g，固定化細胞達 89.2±4.2 ng/g2627。

l IL-1β 未觀察到積累23。

2. 肽的定位與比值變化

1. Aβ40 在細胞質中積累，rAβ42 在細胞膜外表面聚集24。

2. 比值指數 R（rAβ42/Aβ40）：懸浮細胞從 0.08 升至 0.76，固定化細胞從 0.06 升至 0.42，固定化細胞比值更低25。

3. β1 整合素阻斷的影響：阻斷后，固定化細胞中 TNFα 和 Aβ40 的積累***受抑制（TNFα：72.8±5.5 ng/g；Aβ40：77.9±5.5 ng/g），但仍高于懸浮細胞2829。四、結論1. 固定化細胞對異源 Aβ42 刺激的基本指標水平及響應強度***高于懸浮細胞30。

2. 細胞 - 基質粘附（由 β1 整合素介導）可增強 hPBMCs 的信號轉導和合成活性30。

3. 傳統懸浮培養未考慮細胞粘附因素，可能導致研究健康或 AD 患者來源的 hPBMCs 對外源性刺激的反應時得出錯誤結論30。

關鍵問題：問題：固定化培養的 hPBMCs 與懸浮培養的 hPBMCs 對 rAβ42 刺激的響應存在哪些主要差異？

答案：主要差異體現在響應強度上，固定化細胞的 TNFα 和 Aβ40 積累量***高于懸浮細胞。例如，與 rAβ42 孵育 24 小時后，固定化細胞的 TNFα 含量（161.6±9.2 ng/g）高于懸浮細胞（108.3±11.5 ng/g），Aβ40 含量（89.2±4.2 ng/g）也高于懸浮細胞（67.5±5.1 ng/g）；同時，固定化細胞的 rAβ42/Aβ40 比值上升幅度小于懸浮細胞，且細胞內肽的分布異質性更***252627。

問題：β1 整合素在 hPBMCs 的固定化效應中起到了怎樣的作用？

答案：β1 整合素介導了細胞與基質的粘附，對固定化 hPBMCs 的促淀粉樣蛋白生成和促炎狀態有重要影響。與 β1 整合素阻斷抗體孵育后，固定化細胞在 rAβ42 處理下的 TNFα 和 Aβ40 積累***受抑制，但仍高于懸浮細胞，表明 β1 整合素是細胞 - 基質粘附增強細胞響應的關鍵介質之一152829。

問題：本研究為何認為傳統懸浮培養可能導致錯誤結論？

答案：因為懸浮培養未包含細胞通過粘附***的因素，而細胞間及細胞 - 基質粘附是 hPBMCs 活化的關鍵因素，在體內始終存在。例如，單核細胞產生自由氧種類的強度受整合素粘附受體調控，且 AD 患者的 PBMC 在懸浮培養時對 β- 淀粉樣肽刺激表現出抵抗性，忽視細胞粘附可能導致對細胞對外源性刺激的反應評估不準確230。

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